1.檢測試劑的準備 
① Renilla 螢光素酶 plus 檢測底物（100×) , 每次開蓋前需進行短暫低速離心。

②Renilla 螢光素酶 plus 檢測工作液配制：根據(jù)實際使用量，以 100:1 的比例將適量的 Renilla 螢光素酶 plus 檢測緩沖液與 Renilla 螢光素酶 plus 檢測底物（100×) 混勻，室溫避光備用。例如，將1mL Renilla 螢光素酶 plus 檢測底物加入 100mL Renilla 螢光素酶 plus 檢測緩沖液并充分混勻，即可制得 101mL Renilla 螢光素酶 plus檢測工作液。
注：建議現(xiàn)配現(xiàn)用，剩余的工作液當次實驗結(jié)束后，直接舍棄，不要留存。 
 
2.操作方法

（1）細胞檢測

 ① 從細胞培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)板，放置 5-15min ，恢復至室溫。
 ② Renilla Luciferase 反應檢測

使用多道排槍向每個細胞孔中加入平衡至室溫的含有底物的 Renilla 螢光素酶 plus檢測工作液，加樣體積與初始細胞培養(yǎng)液體積相同并充分混勻。例如，96孔板建議加入100μL培養(yǎng)液，相應加入100μL檢測工作液。孵育5min后于化學發(fā)光儀或多功能酶標儀中檢測 Renilla Luciferase 報告基因活性。
 

（2）細胞裂解后的樣品檢測

·裂解細胞

a.貼壁細胞：吸去細胞培養(yǎng)基，用PBS緩慢輕柔地洗滌一次，洗去殘留的培養(yǎng)基，然后將液體全部吸棄。懸浮細胞：離心去上清后，用PBS清洗細胞一次，再次離心收集細胞沉淀。
b. 配制1×細胞裂解工作液。每次使用前以1:4 比例將螢光素酶報告基因細胞裂解液（5×）與 ddH2O充分混合（例如將1mL 螢光素酶報告基因細胞裂解液（5×）加入 4mL ddH2O充分混合），置于冰上備用。
c. 按照下表推薦加入適量的1×細胞裂解工作液，室溫下靜置或振動搖晃裂解15min ，吹打并吸取全部細胞裂解產(chǎn)物至1.5mL離心管中，12000g 離心 5-10min ，取上清用于后續(xù)檢測。

注：若螢光素酶的表達水平過低，可適當減少細胞裂解液用量以提高蛋白濃度，但需保證裂解液體 積可以覆蓋細胞孔板底面，否則會影響裂解效果。
 

·Renilla Luciferase 反應檢測 
①小心吸取 20μL細胞裂解上清依次加入至檢測管或酶標板中，再加入 100μL平衡至室溫的含有底物的Renilla螢光素酶plus檢測工作液。
②孵育5min后于化學發(fā)光儀或多功能酶標儀中檢測Renilla Luciferase報告基因活性。
注：如果對于數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性要求不太高，可以在混勻后立即進行化學發(fā)光檢測。
 
保存條件
未開封試劑盒-20℃保存，自生產(chǎn)之日起12個月有效。 
 

注意事項
1. 檢測儀器選擇：能夠檢測化學發(fā)光的儀器都適用本試劑盒的檢測，但是針對相同的樣品，不同檢測器 本底信號值和測量值均可能不同；且對于同一樣本檢測，不同儀器的數(shù)值不可橫向比較。為防止孔間干 擾，推薦使用不透明白色或黑色細胞培養(yǎng)板。
2. 由于發(fā)光信號會受到檢測環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響，所以應確保同組內(nèi)不同樣本檢測條件一致。
3. 酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將檢測試劑以及細胞培養(yǎng)板平衡至室溫。
4. 如需同時檢測多個細胞培養(yǎng)板，請盡量確保每個細胞板加入檢測溶液后孵育時間一致，再進行數(shù)據(jù)讀取，以此獲得最佳的檢測結(jié)果。
5. Renilla 螢光素酶 plus檢測底物（100×）配制在無水乙醇中。由于無水乙醇容易揮發(fā)，有時會在初次使用時發(fā)現(xiàn)體積明顯小于包裝規(guī)格的情況，此時用無水乙醇把體積補足至包裝規(guī)格，混勻后即可使用。
6. 海腎螢光素酶催化的生物發(fā)光的最強波長為480 nm。